Perbezaan Utama – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green dan Taqman ialah dua kaedah yang digunakan untuk mengesan atau menonton proses penguatan PCR masa nyata. SYBR Green ialah kaedah berasaskan pewarna pewarna asid nukleik interkalasi manakala Taqman ialah kaedah berdasarkan probe hidrolisis. Kedua-dua teknologi direka untuk menjana pendarfluor semasa PCR, yang membolehkan mesin PCR masa nyata memantau tindak balas dalam "masa nyata". Kaedah SYBR Green dijalankan menggunakan pewarna pendarfluor yang dipanggil SYBR green dan mengesan amplifikasi dengan mengikat pewarna untuk menghasilkan DNA untai berganda. Taqman dijalankan menggunakan probe dwi-label dan mengesan penguatan melalui degradasi probe oleh Taq polymerase dan pelepasan fluorophore. Inilah perbezaan utama antara SYBR Green dan Taqman.
Apakah itu SYBR Green?
SYBR Green ialah pewarna pendarfluor yang digunakan untuk mengotorkan asid nukleik, terutamanya DNA untai ganda dalam Biologi Molekul. Kaedah SYBR Green digunakan untuk mengukur produk PCR semasa PCR masa nyata. Sebaik sahaja ia mengikat dengan DNA, kompleks pewarna DNA yang terhasil menyerap cahaya biru dan memancarkan cahaya hijau yang sengit. Ia berlaku disebabkan oleh perubahan struktur yang berlaku dalam molekul pewarna apabila diikat dengan DNA rantai dua. Apabila PCR mencipta lebih banyak DNA, lebih banyak molekul pewarna terikat dengan DNA, menghasilkan lebih banyak pendarfluor. Oleh itu, pendarfluor meningkat dengan pengumpulan produk PCR. Oleh itu, jumlah produk PCR boleh diukur secara kuantitatif dengan pengesanan pendarfluor Hijau SYBR.
SYBR pewarna hijau juga boleh digunakan untuk pelabelan DNA dalam sitometri dan mikroskop pendarfluor. Etidium bromida telah berjaya digantikan dengan SYBR Green kerana Ethidium bromide ialah pewarna karsinogenik dengan masalah pembuangan semasa visualisasi DNA dalam elektroforesis gel.
Terdapat kelebihan dan kekurangan kaedah hijau SYBR. Kaedah ini sangat sensitif, murah dan mudah digunakan. Walau bagaimanapun, disebabkan keupayaannya untuk mengikat mana-mana DNA untai dua, pengikatan tidak spesifik boleh menyebabkan lebihan kuantiti produk PCR.
Rajah 01: Teknik Hijau SYBR
Apakah Taqman?
Taqman ialah kaedah alternatif kepada SYBR Green untuk memantau proses PCR masa nyata. Kaedah ini bergantung kepada aktiviti exonuclease 5’ – 3’ enzim Taq polimerase untuk merendahkan probe semasa lanjutan untaian baru dan pembebasan fluorophore. Probe berlabel dwi digunakan dalam kaedah ini dan ia berdasarkan hidrolisis probe. Prob ialah oligonukleotida DNA berlabel pendarfluor yang mempunyai molekul wartawan pendarfluor (fluorophore) pada hujung 5' dan molekul pelindapkejut pada hujung 3'. Ia direka bentuk untuk mengikat templat terkandas tunggal di bahagian bertentangan anil primer. Taq polymerase menambah nukleotida pada primer dan memanjangkan helai baru ke arah probe dwi-label. Setelah polimerase Taq bertemu probe, tindakan exonuclease bagi polimerase Taq mengaktifkan dan merendahkan probe. Sebaik sahaja ia melengkapkan sintesis untaian baru, probe tertakluk kepada degradasi lengkap dan melepaskan fluorophore. Pembebasan fluorofor menjana pendarfluor. Molekul Fluorescent Quencher secara cekap memadamkan cahaya yang dipancarkan dan mencipta output untuk kuantifikasi produk PCR. Pembebasan fluorofor dan kuantiti produk PCR adalah berkadar. Oleh itu, kuantifikasi boleh dilakukan dengan mudah dengan kaedah Taqman.
Rajah 02: Kaedah Taqman
Kaedah Taqman digunakan dalam PCR masa nyata, kuantifikasi ekspresi gen, pengesanan polimorfisme genetik, kuantifikasi pemadaman DNA kromosom, pengenalpastian bakteria, pengesahan analisis microarray, genotaip SNP dll.
Apakah perbezaan antara hijau SYBR dan Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green adalah berasaskan pewarna pengikat DNA. | Taqman bergantung pada probe hibridisasi dan aktiviti exonuclease 5’ hingga 3’ Taq polymerase. |
| Prob Berlabel Fluoresen | |
| Tiada kuar berlabel pendarfluor tidak diperlukan. | Probe berlabel dwi-label diperlukan. |
| Analisis Gen Multipleks | |
| Ia tidak boleh digunakan untuk sasaran gen multipleks. | Ia boleh digunakan untuk sasaran gen multipleks. |
| Kos | |
| Ini lebih murah. | Ini lebih mahal. |
| Kekhususan | |
| Ini kurang spesifik dan terikat dengan mana-mana DNA untai ganda | Ini sangat spesifik kerana probe mengesan produk amplifikasi tertentu. |
| Keberkesanan | |
| Ini kurang berkesan. | Ini sangat berkesan. |
| Permohonan | |
| Ini digunakan dalam PCR masa nyata, visualisasi gel agarose, pelabelan DNA dll. | Ini digunakan dalam PCR masa nyata, kuantifikasi ekspresi gen, pengesanan polimorfisme genetik, dsb. |
Ringkasan – SYBR Green and Taqman
Taqman dan SYBR green ialah dua kaedah yang digunakan dalam PCR masa nyata (PCR kuantitatif). Kedua-dua kaedah membolehkan pengiraan produk PCR dengan cekap dan bergantung pada pancaran pendarfluor. Kaedah Taqman menggunakan probe dwi-label untuk pengesanan DNA terkumpul manakala kaedah SYBR Green menggunakan pewarna pendarfluor. Kedua-dua kaedah ini juga mempunyai aplikasi yang berbeza dalam biologi molekul.
