Perbezaan Utama – Pengklonan Gen lwn PCR
Sintesis banyak salinan DNA daripada serpihan DNA tertentu dipanggil penguatan DNA. Terdapat dua proses penguatan DNA utama iaitu pengklonan gen dan PCR. Perbezaan utama antara pengklonan gen dan PCR ialah, pengklonan gen menghasilkan berbilang salinan gen tertentu dalam vivo dengan membina DNA rekombinan dan berkembang di dalam bakteria perumah manakala PCR menghasilkan berjuta-juta salinan serpihan DNA tertentu secara in vitro menjalani kitaran berulang. denaturasi dan sintesis.
Apakah Pengklonan Gen?
Pengklonan gen ialah teknik yang digunakan untuk mencari dan membiak gen tertentu daripada DNA genomik yang diekstrak organisma melalui pembinaan DNA rekombinan. DNA genomik mengandungi beribu-ribu gen berbeza yang dikodkan untuk protein. Apabila DNA diekstrak, ia merangkumi semua kemungkinan gen yang boleh ditanggungnya. Teknik pengklonan gen telah membolehkan pengesanan gen tertentu daripada jumlah DNA. Oleh itu pengklonan gen berfungsi sebagai alat penting dalam biologi molekul.
Pembuatan perpustakaan genomik organisma adalah penting dalam pengklonan gen jika tiada petunjuk tentang lokasi gen yang berkaitan dalam DNA. Pustaka genomik dibuat menggunakan langkah berikut.
Langkah 1: Pengekstrakan jumlah DNA daripada organisma yang mengandungi gen yang dikehendaki.
Langkah 2: Hadkan penghadaman DNA yang diekstrak untuk menghasilkan serpihan kecil yang boleh diurus. Langkah ini difasilitasi oleh endonuklease sekatan.
Langkah 3: Pemilihan vektor yang sesuai dan membuka DNA vektor menggunakan endonuklease sekatan yang sama. Plasmid bakteria biasanya digunakan sebagai vektor untuk membawa DNA asing. Plasmid ialah bulatan kecil DNA yang terletak dalam bakteria.
Langkah 4: Menggabungkan DNA vektor dan DNA berserpihan untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan. Langkah ini dikawal oleh ligase DNA.
Langkah 5: Memindahkan molekul DNA rekombinan ke dalam bakteria perumah. Langkah ini dikenali sebagai transformasi dan dilakukan menggunakan renjatan haba.
Langkah 5: Penyaringan sel bakteria yang telah diubah pada medium kultur. Populasi campuran sel perumah yang berubah dan tidak berubah diperoleh pada akhir proses transformasi. Oleh kerana gen yang diminati hanya termasuk dalam sel perumah yang berubah. Oleh itu, adalah perlu untuk memilih sel yang diubah. Pemilihan dibuat menggunakan media terpilih yang mengandungi antibiotik. Hanya sel yang diubah suai tumbuh pada medium penyaringan ini yang membolehkan pemilihan.
Langkah 6: Pembiakan bakteria untuk menghasilkan perpustakaan gen. Dalam langkah ini, sel perumah yang diubahsuai diperkenalkan ke dalam media kultur segar yang menyediakan keperluan pertumbuhan optimum. Jumlah koloni pada plat kultur mewakili perpustakaan genomik organisma itu.
Langkah 7: Molekul DNA rekombinan yang mengandungi gen yang diminati mesti disaring daripada beribu-ribu serpihan klon DNA rekombinan. Ia boleh dicapai dengan menggunakan probe yang menandakan gen tertentu atau hasil protein khusus daripada gen tersebut.
Setelah gen berminat yang mengandungi koloni bakteria dikenal pasti daripada jumlah koloni, adalah mungkin untuk membuat berjuta-juta salinan plasmid rekombinan yang mengandungi gen itu.
Pengklonan gen digunakan dalam mewujudkan perpustakaan gen, menghasilkan protein khas, vitamin, antibiotik, hormon, penjujukan dan pemetaan genom organisma, membuat beberapa salinan DNA individu dalam forensik dsb.
Rajah_1: Pengklonan Gen
Apakah itu PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) ialah teknik yang menghasilkan sejumlah besar salinan serpihan DNA tertentu. Penguatan eksponen bagi urutan DNA tertentu diperolehi oleh PCR di bawah keadaan in vitro. Teknik ini adalah alat yang sangat berkuasa dalam Biologi Molekul kerana ia boleh membiak sampel kecil DNA ke dalam jumlah yang boleh digunakan. PCR telah diperkenalkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ciptaan yang memenangi hadiah ini mencipta kemajuan besar dalam Biologi Molekul.
Teknik PCR mengikut tindak balas PCR berulang seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 02. Satu tindak balas PCR terdiri daripada tiga langkah utama yang berlaku pada tiga suhu berbeza; denaturasi untaian berganda pada DNA pada 94 0C, penyepuhlindapan primer pada 68 0C dan pemanjangan untai pada 72 0 C. Oleh itu, apabila PCR dilakukan, turun naik suhu harus sangat dikekalkan untuk replikasi yang betul. PCR dilakukan dalam mesin PCR di dalam tiub PCR. Tiub PCR dimuatkan dengan campuran PCR yang betul yang mengandungi DNA templat, polimerase Taq, primer, dNTP dan penimbal. Pendenaturan DNA sampel untai ganda kepada DNA untai tunggal dilakukan dengan memecahkan ikatan hidrogen antara bes pelengkap pada 94 – 98 0C. Kemudian helai tunggal DNA templat didedahkan untuk primer. Sepasang primer (ke hadapan dan belakang) perlu disediakan, dan ia hendaklah termostable untuk bertolak ansur dengan suhu tinggi. Primer ialah urutan DNA pendek untaian tunggal yang melengkapi hujung serpihan DNA sasaran. Primer sintetik digunakan dalam PCR. Primer mengikat dengan asas pelengkap DNA sampel dan memulakan sintesis untaian baru. Langkah ini dimangkinkan oleh enzim yang dipanggil Taq polimerase; enzim polimerase DNA termostabil yang diasingkan daripada Thermus auqaticus. Apabila primer dan nukleotida (blok binaan) tersedia, Taq polymerase membina untaian DNA baharu yang pelengkap kepada DNA templat. Pada akhir program PCR, serpihan DNA yang diperkuat diperhatikan menggunakan elektroforesis gel. Jika analisis lanjut diperlukan, produk PCR disucikan daripada gel.
PCR sangat berguna untuk mendiagnosis dan memantau penyakit genetik dan diperolehi, mengenal pasti penjenayah (dalam bidang forensik), mengkaji struktur dan fungsi segmen DNA yang disasarkan, penjujukan dan pemetaan genom organisma, dan lain-lain. PCR telah menjadi teknik makmal rutin dalam makmal penyelidikan perubatan dan biologi molekul dalam kalangan saintis kerana ia mempunyai pelbagai jenis aplikasi.
Rajah_2: Tindak balas Rantaian Polimerase
Apakah perbezaan antara Pengklonan Gen dan PCR?
Pengklonan Gen lwn PCR |
|
| Pengklonan gen ialah proses membuat beberapa salinan gen tertentu dalam vivo melalui DNA rekombinan dan berubah menjadi bakteria perumah. | Teknik PCR menghasilkan berbilang salinan jujukan DNA tertentu secara in vitro melalui kitaran tindak balas PCR yang berulang. |
| Keperluan Membina DNA Rekombinan | |
| DNA rekombinan dihasilkan untuk mengesan gen. | DNA rekombinan tidak dihasilkan. |
| Keperluan Buruh | |
| Proses ini adalah intensif buruh. | Buruh intensif tidak diperlukan. |
| Proses in vivo atau In vitro | |
| Pembinaan DNA rekombinan adalah secara in vitro dan penguatan DNA adalah dalam vivo. | Penguatan DNA berlaku sepenuhnya dalam vitro. |
Ringkasan – Pengklonan Gen lwn PCR
Pengklonan gen dan PCR ialah dua kaedah yang digunakan untuk penguatan DNA. PCR ialah proses in vitro yang membuat beberapa salinan DNA bagi serpihan DNA tertentu tanpa menggunakan DNA rekombinan dan organisma perumah. Pengklonan gen adalah terutamanya proses in vivo yang menghasilkan berbilang salinan gen yang berminat di dalam organisma tuan rumah melalui pembinaan DNA rekombinan. Ini ialah perbezaan antara pengklonan gen dan PCR.
