Perbezaan Utama – Microarray vs RNA Sequencing
Transkriptom mewakili keseluruhan kandungan RNA yang terdapat dalam sel termasuk mRNA, rRNA, tRNA, RNA terdegradasi dan, RNA tidak terdegradasi. Pemprofilan transkrip adalah proses penting untuk memahami cerapan sel. Terdapat beberapa kaedah lanjutan untuk pemprofilan transkriptom. Penjujukan Microarray dan RNA ialah dua jenis teknologi yang dibangunkan untuk menganalisis transkriptom. Perbezaan utama antara penjujukan microarray dan RNA ialah microarray adalah berdasarkan potensi hibridisasi probe berlabel yang telah direka bentuk dengan urutan cDNA sasaran manakala penjujukan RNA adalah berdasarkan penjujukan langsung helai cDNA oleh teknik penjujukan lanjutan seperti NGS. Microarray dilakukan dengan pengetahuan terdahulu tentang jujukan dan jujukan RNA dilakukan tanpa pengetahuan awal tentang jujukan.
Apakah itu Microarray?
Microarray ialah kaedah pemprosesan yang teguh, boleh dipercayai dan tinggi yang digunakan untuk pemprofilan transkrip oleh saintis. Ia adalah pendekatan yang paling popular untuk analisis transkrip. Ia merupakan kaedah kos rendah, yang bergantung pada probe hibridisasi.
Teknik ini bermula dengan pengekstrakan mRNA daripada sampel dan pembinaan perpustakaan cDNA daripada jumlah RNA. Kemudian ia dicampur dengan probe prareka bentuk berlabel pendarfluor pada permukaan pepejal (matriks titik). Urutan pelengkap berhibrid dengan probe berlabel dalam microarray. Kemudian microarray dibasuh dan disaring, dan imej dikira. Data yang dikumpul hendaklah dianalisis untuk mendapatkan profil ungkapan relatif.
Keamatan probe microarray diandaikan berkadar dengan kuantiti transkrip dalam sampel. Walau bagaimanapun, ketepatan teknik bergantung kepada probe yang direka, pengetahuan terdahulu tentang urutan dan pertalian probe untuk hibridisasi. Oleh itu teknologi microarray mempunyai batasan. Teknik microarray tidak boleh dilakukan dengan transkrip kelimpahan yang rendah. Ia gagal membezakan isoform dan mengenal pasti varian genetik. Memandangkan kaedah ini bergantung pada penghibridan probe, beberapa masalah yang berkaitan dengan penghibridan seperti penghibridan silang, penghibridan tidak spesifik dll. berlaku dalam teknik microarray.
Rajah 01: Microarray
Apakah itu RNA Sequencing?
Penjujukan senapang patah RNA (RNA seq) ialah teknik penjujukan keseluruhan transkriptom yang dibangunkan baru-baru ini. Ia merupakan kaedah pemprofilan transkriptom yang pantas dan tinggi. Ia secara langsung mengukur ekspresi gen dan menghasilkan penyiasatan mendalam terhadap transkrip. RNA seq tidak bergantung pada probe yang direka bentuk atau pengetahuan terdahulu tentang jujukan. Oleh itu, kaedah RNA seq mempunyai kepekaan dan keupayaan yang tinggi untuk mengesan gen baru dan varian genetik.
Kaedah penjujukan RNA dilakukan melalui beberapa langkah. Jumlah RNA sel mesti diasingkan dan berpecah-belah. Kemudian, menggunakan transkripase terbalik, perpustakaan cDNA mesti disediakan. Setiap helai cDNA mesti diikat dengan penyesuai. Kemudian serpihan yang diikat mesti dikuatkan dan disucikan. Akhirnya menggunakan kaedah NGS, penjujukan cDNA mesti dilakukan.
Rajah 02: Penjujukan RNA
Apakah perbezaan antara penjujukan Microarray dan RNA?
Microarray vs RNA Sequencing |
|
| Microarray ialah kaedah daya pemprosesan yang teguh, boleh dipercayai dan tinggi. | Penjujukan RNA ialah kaedah yang tepat dan tinggi. |
| Kos | |
| Ini ialah kaedah kos rendah. | Ini adalah kaedah yang mahal. |
| Analisis Sebilangan Besar Sampel | |
| Ini memudahkan anda menganalisis sejumlah besar sampel secara serentak. | Ini memudahkan anda menganalisis sejumlah besar sampel. |
| Analisis Data | |
| Analisis data adalah rumit. | Lebih banyak data dijana dalam kaedah ini; oleh itu, prosesnya lebih kompleks. |
| Pengetahuan Terdahulu tentang Urutan | |
| Kaedah ini berdasarkan probe hibridisasi, jadi pengetahuan awal tentang jujukan diperlukan. | Kaedah ini tidak bergantung pada pengetahuan urutan sebelumnya. |
| Variasi Struktur dan Gen Novel | |
| Kaedah ini tidak dapat mengesan variasi struktur dan gen baru. | Kaedah ini boleh mengesan variasi struktur seperti gabungan gen, penyambungan alternatif dan gen baru. |
| Sensitiviti | |
| Ini tidak dapat mengesan perbezaan dalam ekspresi isoform, jadi ini mempunyai sensitiviti terhad. | Ini mempunyai sensitiviti tinggi. |
| Hasil | |
| Ini hanya boleh menghasilkan tahap ekspresi relatif. Ini tidak memberikan kuantifikasi mutlak ekspresi gen. | Ia memberikan tahap ekspresi mutlak dan relatif. |
| Analisis Semula Data | |
| Ini perlu disiarkan semula untuk menganalisis semula. | Data penjujukan boleh dianalisis semula. |
| Keperluan untuk Kakitangan dan Infrastruktur Tertentu | |
| Infrastruktur dan kakitangan khusus tidak diperlukan untuk susunan mikro. | Infrastruktur dan kakitangan khusus yang diperlukan oleh penjujukan RNA. |
| Isu Teknikal | |
| Teknik Microarray mempunyai isu teknikal seperti hibridisasi silang, hibridisasi tidak spesifik, kadar pengesanan terhad bagi probe individu, dsb. | Teknik seq RNA mengelakkan isu teknikal seperti hibridisasi silang, hibridisasi tidak spesifik, kadar pengesanan terhad bagi probe individu, dsb. |
| Biases | |
| Ini ialah kaedah berat sebelah kerana ia bergantung pada penghibridan. | Bias adalah rendah berbanding susunan mikro. |
Ringkasan – Microarray vs RNA Sequencing
Kaedah penjujukan Microarray dan RNA ialah platform pemprosesan tinggi yang dibangunkan untuk pemprofilan transkriptom. Kedua-dua kaedah menghasilkan keputusan yang sangat berkorelasi dengan profil ekspresi gen. Walau bagaimanapun, penjujukan RNA mempunyai kelebihan berbanding microarray untuk analisis ekspresi gen. Penjujukan RNA adalah kaedah yang lebih sensitif untuk pengesanan transkrip kelimpahan rendah daripada microarray. Penjujukan RNA juga membolehkan pembezaan antara isoform dan pengenalpastian varian gen. Walau bagaimanapun, microarray ialah pilihan biasa kebanyakan penyelidik memandangkan penjujukan RNA ialah teknik baharu dan mahal dengan cabaran penyimpanan data dan analisis data yang kompleks.
