Perbezaan Utama – Penjujukan Sanger lwn Pyrosequencing
Penjujukan DNA adalah sangat penting untuk analisis DNA kerana pengetahuan tentang susunan nukleotida yang betul pada rantau DNA tertentu mendedahkan banyak maklumat penting mengenainya. Terdapat kaedah penjujukan DNA yang berbeza. Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing ialah dua kaedah penjujukan DNA berbeza yang digunakan secara meluas dalam Biologi Molekul. Perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan Pyrosequencing ialah penjujukan Sanger menggunakan dideoxynucleotides untuk menamatkan sintesis DNA untuk membaca jujukan nukleotida manakala pyrosequencing mengesan pembebasan pirofosfat dengan menggabungkan nukleotida dan mensintesis jujukan pelengkap untuk membaca susunan jujukan yang tepat.
Apakah itu Penjujukan Sanger?
Penjujukan Sanger ialah kaedah penjujukan DNA generasi pertama yang dibangunkan oleh Frederick Sanger dan kolejnya pada tahun 1977. Ia juga dikenali sebagai Penjujukan Penamatan Rantaian atau penjujukan Dideoksi kerana ia berdasarkan penamatan rantai oleh dideoxynucleotides (ddNTPs). Kaedah ini telah digunakan secara meluas selama lebih 30 tahun sehinggalah New Generation Sequencing (NGS) dibangunkan. Teknik penjujukan Sanger membolehkan penemuan susunan nukleotida yang betul atau lampiran serpihan DNA tertentu. Ia berdasarkan penggabungan terpilih ddNTP dan penamatan sintesis DNA semasa replikasi DNA in vitro. Ketiadaan kumpulan 3' OH untuk meneruskan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida bersebelahan adalah ciri unik ddNTPs. Oleh itu, sebaik sahaja ddNTP dipasang, pemanjangan rantai terhenti dan tamat dari titik itu. Terdapat empat ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP - digunakan dalam penjujukan Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA apabila ia digabungkan ke dalam untaian DNA yang semakin meningkat dan menghasilkan panjang DNA pendek yang berbeza-beza. Elektroforesis gel kapilari digunakan untuk menyusun helai DNA pendek ini mengikut saiznya pada gel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 01.
Rajah 1: Elektroforesis gel kapilari DNA pendek tersintesis
Untuk replikasi DNA secara in vitro, beberapa keperluan perlu disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA templat, primer oligonukleotida, dan deoksinukleotida (dNTPs). Dalam penjujukan Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tabung uji berasingan bersama empat jenis ddNTP secara berasingan. Deoxynucleotides tidak digantikan sepenuhnya oleh ddNTP masing-masing. Campuran dNTP tertentu (contohnya; dATP + ddATP) dimasukkan ke dalam tiub dan direplikasi. Empat produk tiub berasingan dijalankan pada gel dalam empat telaga berasingan. Kemudian dengan membaca gel, urutan boleh dibina seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 02.
Rajah 02: Penjujukan Sanger
Penjujukan Sanger ialah teknik penting yang membantu dalam banyak bidang biologi molekul. Projek genom manusia telah berjaya disiapkan dengan bantuan kaedah berasaskan penjujukan Sanger. Penjujukan Sanger juga berguna dalam penjujukan DNA sasaran, penyelidikan kanser dan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, pengenalan manusia, pengesanan patogen, penjujukan mikrob dll.
Terdapat beberapa kelemahan penjujukan Sanger:
- Panjang DNA yang dijujukan tidak boleh melebihi 1000 pasangan asas
- Hanya satu helai boleh disusun pada satu masa.
- Prosesnya memakan masa dan mahal.
Oleh itu, teknik penjujukan lanjutan baharu telah dibangunkan mengikut masa untuk mengatasi masalah ini. Walau bagaimanapun, penjujukan Sanger masih digunakan kerana hasil yang sangat tepat sehingga kira-kira 850 serpihan panjang pasangan asas.
Apakah itu Pyrosequencing?
Pyrosequencing ialah teknik penjujukan DNA baru berdasarkan "penjujukan melalui sintesis". Teknik ini bergantung pada pengesanan pembebasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim berbeza: polimer DNA, ATP sulfurilase, luciferase dan apirase dan dua substrat adenosin 5’ phosphosulfate (APS) dan luciferin.
Proses bermula dengan pengikatan primer dengan templat DNA untai tunggal dan polimerase DNA memulakan penggabungan nukleotida yang pelengkap kepadanya. Apabila nukleotida bergabung bersama (pempolimeran asid nukleik), ia membebaskan kumpulan dan tenaga pirofosfat (dua kumpulan fosfat yang terikat bersama). Setiap penambahan nukleotida membebaskan kuantiti equimolar pirofosfat. Pyrophosphate bertukar menjadi ATP oleh ATP sulfurylase dengan kehadiran substrat APS. ATP yang dijana memacu penukaran luciferin yang dimediasi luciferase kepada oxyluciferin, menghasilkan cahaya yang boleh dilihat dalam jumlah yang berkadar dengan jumlah ATP. Cahaya dikesan oleh peranti pengesan foton atau oleh photomultiplier dan mencipta pyrogram. Apyrase merendahkan ATP dan dNTP yang tidak digabungkan dalam campuran tindak balas. Penambahan dNTP dilakukan sekali pada satu masa. Oleh kerana penambahan nukleotida diketahui mengikut penggabungan dan pengesanan cahaya, urutan templat boleh ditentukan. Pirogram digunakan untuk menjana jujukan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 03.
Pyrosequencing adalah sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan penjujukan regangan pendek DNA. Ketepatan tinggi, fleksibiliti, kemudahan automasi dan pemprosesan selari adalah kelebihan pyrosequencing berbanding teknik penjujukan Sanger.
Rajah 03: Pyrosequencing
Apakah perbezaan antara Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing?
Penjujukan Sanger lwn Pyrosequencing |
|
| Penjujukan Sanger ialah kaedah penjujukan DNA berdasarkan penggabungan terpilih ddNTP oleh polimerase DNA dan penamatan rantai. | Pyrosequencing ialah kaedah penjujukan DNA berdasarkan pengesanan pembebasan pirofosfat apabila nukleotida tergabung. |
| Penggunaan ddNTP | |
| ddNTP digunakan untuk menamatkan replikasi DNA | ddNTP tidak digunakan. |
| Enzim yang terlibat | |
| DNA polimerase digunakan. | Empat enzim digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurilase, Luciferase dan Apyrase. |
| Substrat Digunakan | |
| APS dan Luciferin tidak digunakan. | Adenosine 5’ phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan. |
| Suhu Maksimum | |
| Ini adalah proses yang perlahan. | Ini adalah proses yang pantas. |
Ringkasan – Penjujukan Sanger lwn Pyrosequencing
Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing ialah dua kaedah penjujukan DNA yang digunakan dalam biologi molekul. Penjujukan Sanger membina susunan nukleotida mengikut jujukan dengan menamatkan pemanjangan rantai manakala penjujukan pirose membina susunan nukleotida yang tepat dalam jujukan dengan menggabungkan nukleotida dan mengesan pembebasan pirofosfat. Oleh itu, perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan Pyrosequencing ialah penjujukan Sanger berfungsi pada penjujukan melalui penamatan rantai manakala penjujukan Sanger berfungsi pada penjujukan melalui sintesis.
