Perbezaan Utama – Pembuangan Utara lwn Selatan lwn Barat
Pengesanan urutan spesifik DNA, RNA dan protein adalah penting untuk pelbagai jenis kajian dalam biologi Molekul. Elektroforesis gel adalah teknik yang memisahkan DNA, RNA, dan protein mengikut saiznya. Daripada profil gel, jujukan DNA tertentu, jujukan RNA, atau protein dikesan dengan teknik khas yang dipanggil blotting dan hibridisasi dengan probe berlabel. Terdapat tiga jenis kaedah blotting yang berbeza iaitu selatan, utara dan barat. Perbezaan utama antara penghapusan selatan utara dan barat terletak pada jenis molekul yang dikesan daripada sampel. Southern blotting ialah kaedah yang mengesan urutan DNA tertentu daripada sampel DNA. Northern blotting ialah teknik yang mengesan urutan RNA tertentu daripada sampel RNA. Western blotting ialah kaedah yang mengesan protein tertentu daripada sampel protein.
Apakah itu Southern Blotting?
Teknik blotting Selatan telah dibangunkan oleh E. M. Southern pada tahun 1975 untuk mengenal pasti urutan DNA tertentu daripada sampel DNA. Ini adalah teknik blotting pertama yang diperkenalkan dalam biologi molekul. Ia membolehkan pengesanan gen tertentu daripada DNA, serpihan khusus daripada DNA, dsb. Terdapat beberapa langkah yang terlibat dalam teknik blotting selatan. Ia adalah seperti berikut.
- DNA diasingkan daripada sampel dan dicerna dengan endonuklease sekatan.
- Sampel yang dicerna dipisahkan oleh elektroforesis gel Agarose.
- serpihan DNA dalam gel didenaturasikan menjadi helai tunggal dengan menggunakan larutan alkali.
- DNA terkandas tunggal dipindahkan ke membran penapis nitroselulosa melalui pemindahan kapilari.
- DNA yang dipindahkan dilekatkan pada membran secara kekal.
- DNA tetap pada membran dihibridkan dengan probe berlabel.
- DNA yang tidak terikat dicuci dari membran dengan mencuci.
- Filem sinar-X terdedah kepada membran dan autoradiograf disediakan.
Southern blotting digunakan untuk pelbagai aspek biologi molekul. Ia berguna dalam pemetaan RFLP, kajian forensik, metilasi DNA dalam ekspresi gen, pengesanan gen bermutasi dalam gangguan genetik, cap jari DNA, dsb.
Rajah 01: Teknik Southern Blotting
Apakah Northern Blotting?
Northern blotting ialah kaedah yang direka untuk mengesan jujukan RNA atau jujukan mRNA tertentu daripada sampel untuk mengkaji ekspresi gen. Teknik ini telah dibangunkan oleh Alwine, Kemp, dan Stark pada tahun 1979. Ia berbeza daripada teknik sourthern dan western blotting kerana beberapa langkah. Walau bagaimanapun, teknik ini juga dilakukan melalui elektroforesis gel, blotting, dan hibridisasi dengan probe dan pengesanan berlabel khusus. Teknik Northern blotting dilakukan seperti berikut.
- RNA diekstrak daripada sampel dan dipisahkan oleh elektroforesis gel.
- RNA dipindahkan daripada gel ke membran blotting dan tetap.
- Membran dirawat dengan probe berlabel yang disediakan daripada cDNA atau RNA (probe adalah pelengkap kepada urutan tertentu dalam sampel).
- Probe diinkubasi dengan membran untuk mengikat dengan urutan tertentu.
- Probe yang tidak terikat telah dihapuskan.
- serpihan hibrid dikesan oleh autoradiograf.
Northern blotting ialah alat penting dalam pengesanan dan kuantifikasi mRNA hibrid, mengkaji degradasi RNA, penilaian separuh hayat RNA, pengesanan penyambungan RNA, mengkaji ekspresi gen, dsb.
Rajah 02: Pemadaman Utara
Apakah itu Western Blotting?
Western blotting ialah kaedah mengesan protein tertentu daripada campuran protein dengan menggunakan antibodi berlabel. Oleh itu, western blot juga dikenali sebagai imunoblot. Teknik ini telah diperkenalkan oleh Towbin et al pada tahun 1979 dan kini secara rutin dilakukan di makmal untuk analisis protein. Langkah-langkahnya adalah seperti berikut.
- Protein diekstrak daripada sampel
- Protein diasingkan mengikut saiznya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida
- Molekul yang diasingkan dipindahkan ke dalam membran PVDF atau membran nitroselulosa melalui elektroporasi
- Membran disekat kerana pengikatan tidak spesifik dengan antibodi
- Protein yang dipindahkan terikat dengan antibodi primer (antibodi berlabel enzim).
- Membran dicuci untuk mengeluarkan antibodi primer yang tidak terikat secara spesifik
- Antibodi terikat dikesan dengan menambahkan substrat dan mengesan mendakan berwarna yang terbentuk
Western blotting berguna dalam pengesanan antibodi anti-HIV dalam sampel serum manusia. Western blot juga boleh digunakan sebagai ujian pengesahan untuk jangkitan Hepatitis B dan ujian muktamad untuk penyakit lembu gila.
Rajah 03: Western Blotting
Apakah perbezaan antara Northern Southern dan Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Jenis Molekul Dikesan | |
| Northern Blotting | Northern blotting mengesan jujukan RNA tertentu daripada sampel RNA. |
| Southern Blotting | Southern blotting mengesan urutan DNA tertentu daripada sampel DNA. |
| Western Blotting | Western blotting mengesan protein tertentu daripada sampel protein. |
| Jenis Gel | |
| Northern Blotting | Ini menggunakan gel Agarose/formaldehid. |
| Southern Blotting | Ini menggunakan gel Agarose. |
| Western Blotting | Ini menggunakan gel Polyacrylamide. |
| Kaedah Pembuangan | |
| Northern Blotting | Ini ialah pemindahan kapilari. |
| Southern Blotting | Ini ialah pemindahan kapilari. |
| Western Blotting | Ini ialah pemindahan elektrik. |
| Prob Digunakan | |
| Northern Blotting | cDNA atau kuar RNA dilabel secara radioaktif atau bukan radioaktif. |
| Southern Blotting | probe DNA dilabel secara radioaktif atau bukan radioaktif. |
| Western Blotting | Antibodi utama digunakan sebagai probe. |
| Sistem Pengesanan | |
| Northern Blotting | Ini dilakukan menggunakan autoradiograf, atau pengesanan cahaya atau perubahan warna. |
| Southern Blotting | Ini dilakukan menggunakan autoradiograf, pengesanan cahaya atau perubahan warna. |
| Western Blotting | Ini dilakukan menggunakan pengesanan cahaya atau perubahan warna. |
Ringkasan – Pemadaman Utara lwn Selatan lwn Barat
Blotting ialah teknik khas yang dibangunkan untuk mengenal pasti DNA, RNA atau protein tertentu daripada sampel. Terdapat tiga prosedur blotting berasingan, iaitu utara, selatan dan barat, untuk mengesan jenis molekul tertentu. Teknik blotting utara direka untuk mengesan urutan RNA tertentu daripada campuran RNA. Teknik Southern blotting membolehkan pengesanan urutan DNA tertentu daripada sampel DNA dan teknik western blotting dibangunkan untuk mengenal pasti protein tertentu daripada campuran protein.
