Perbezaan Utama – NGS lwn Sanger Sequencing
Penjujukan Generasi Seterusnya (NGS) dan Penjujukan Sanger ialah dua jenis teknik penjujukan nukleotida yang dibangunkan dari semasa ke semasa. Kaedah Penjujukan Sanger telah digunakan secara meluas selama bertahun-tahun dan NGS menggantikannya baru-baru ini kerana kelebihannya. Perbezaan utama antara NGS dan Penjujukan Sanger ialah NGS berfungsi berdasarkan prinsip penjujukan berjuta-juta jujukan secara serentak dengan cara yang pantas melalui sistem penjujukan manakala Penjujukan Sanger berfungsi pada prinsip penamatan rantai kerana penggabungan terpilih dideoxynucleotides oleh enzim polimerase DNA semasa replikasi DNA dan mengakibatkan pemisahan serpihan oleh elektroforesis kapilari.
Apakah Penjujukan Nukleotida?
Maklumat genetik disimpan dalam jujukan nukleotida DNA atau RNA sesuatu organisma. Proses menentukan susunan nukleotida yang betul (menggunakan empat bes) dalam serpihan tertentu (dalam gen, kelompok gen, kromosom, dan genom lengkap) dikenali sebagai penjujukan nukleotida. Ia sangat penting dalam kajian genomik, kajian forensik, virologi, sistematik biologi, diagnosis perubatan, bioteknologi dan dalam banyak bidang lain untuk menganalisis struktur dan fungsi gen. Terdapat pelbagai jenis kaedah penjujukan yang dibangunkan oleh saintis. Antaranya, penjujukan Sanger yang dibangunkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1977 telah digunakan secara meluas dan dipopularkan untuk jangka masa yang lama sehingga Penjujukan Generasi Seterusnya menggantikannya.
Apakah NGS?
Penjujukan Generasi Seterusnya (NGS) ialah istilah yang digunakan untuk merujuk kepada proses penjujukan daya pemprosesan tinggi moden. Ia menerangkan beberapa teknologi penjujukan moden berbeza yang merevolusikan kajian genomik dan Biologi Molekul. Teknik tersebut ialah penjujukan Illumina, penjujukan Roche 454, penjujukan Ion Proton dan penjujukan SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Sistem NGS lebih cepat dan lebih murah. Empat kaedah penjujukan DNA utama digunakan dalam sistem NGS iaitu; pyrosequencing, penjujukan dengan sintesis, penjujukan dengan ligation dan penjujukan semikonduktor ion. Sebilangan besar helai DNA atau RNA (berjuta-juta) boleh disusun secara selari. Ia membenarkan penjujukan keseluruhan genom organisma dalam tempoh masa yang singkat, tidak seperti penjujukan Sanger yang mengambil lebih banyak masa.
NGS mempunyai banyak kelebihan berbanding kaedah Sanger penjujukan konvensional. Ia adalah proses berkelajuan tinggi, lebih tepat dan menjimatkan kos yang boleh dilakukan dengan saiz sampel yang kecil. NGS boleh digunakan dalam kajian metagenomik, dalam pengesanan variasi dalam genom individu akibat sisipan dan pemadaman dsb. dan dalam analisis ekspresi gen.
Rajah_1: Perkembangan dalam Penjujukan NGS
Apakah itu Penjujukan Sanger?
Sanger Sequencing ialah kaedah penjujukan yang dibangunkan oleh Frederick Sanger dan rakan-rakannya pada tahun 1977 untuk menentukan susunan nukleotida yang tepat bagi serpihan DNA tertentu. Ia juga dikenali sebagai penjujukan penamatan rantai atau penjujukan Dideoxy. Prinsip kerja kaedah ini adalah penamatan sintesis helai dengan penggabungan terpilih dideoxynucleotides penamat rantai (ddNTPs) seperti ddGTP, ddCTP, ddATP dan ddTTP oleh polimerase DNA semasa replikasi DNA. Nukleotida normal mempunyai kumpulan 3’ OH untuk pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida bersebelahan untuk meneruskan pembentukan untai. Walau bagaimanapun, ddNTP kekurangan kumpulan 3' OH ini dan tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester antara nukleotida. Oleh itu, pemanjangan rantai dihentikan.
Dalam kaedah ini, DNA untai tunggal yang akan dijujukan berfungsi sebagai untai templat untuk sintesis DNA in vitro. Keperluan lain ialah primer oligonukleotida, prekursor deoxynucleotide dan enzim polimerase DNA. Apabila hujung mengapit serpihan sasaran diketahui, primer boleh direka bentuk dengan mudah untuk replikasi DNA. Empat tindak balas sintesis DNA berasingan dilakukan dalam empat tiub berasingan. Setiap tiub mempunyai ddNTP yang berasingan, bersama-sama dengan keperluan lain. Daripada nukleotida tertentu, campuran dNTP dan ddNTP ditambah. Begitu juga, empat tindak balas berasingan dilakukan dalam empat tiub dengan empat campuran. Selepas tindak balas, pengesanan serpihan DNA dan penukaran corak serpihan kepada maklumat urutan dilakukan. Serpihan DNA yang terhasil didenaturasi haba dan dipisahkan oleh elektroforesis gel. Jika nukleotida radioaktif digunakan, corak pengikatan dalam gel poliakrilamida boleh divisualisasikan dengan autoradiografi. Apabila kaedah ini menggunakan dideoxynucleotides yang ditag secara pendarfluor, ia boleh mengurangkan bacaan gel dan melalui pancaran laser untuk dikesan oleh pengesan pendarfluor. Untuk mengelakkan ralat yang mungkin timbul apabila urutan dibaca oleh mata dan dimasukkan secara manual ke dalam komputer, kaedah ini berkembang menjadi penggunaan penjujukan automatik yang digabungkan dengan komputer.
Ini ialah kaedah yang digunakan untuk menyusun DNA daripada projek Genom Manusia. Kaedah ini masih digunakan dengan pengubahsuaian lanjutan kerana ia memberikan maklumat urutan yang tepat walaupun proses yang mahal dan lambat.
Rajah_2: Penjujukan Sanger
Apakah perbezaan antara NGS dan Sanger Sequencing?
NGS lwn Sanger Sequencing |
|
| Penjujukan Generasi Seterusnya (NGS) merujuk kepada proses penjujukan daya pemprosesan tinggi moden. Ia menerangkan beberapa teknologi penjujukan moden yang berbeza | Penjujukan Sanger ialah kaedah penjujukan yang dibangunkan oleh Frederick Sanger untuk menentukan susunan nukleotida yang tepat bagi serpihan DNA tertentu. |
| Keberkesanan Kos | |
| NGS ialah proses yang lebih murah kerana ia mengurangkan masa, tenaga manusia dan bahan kimia. | Ini adalah proses yang mahal kerana ia memerlukan masa, tenaga manusia dan lebih banyak bahan kimia. |
| Kelajuan | |
| Ini lebih cepat kerana pengesanan kimia dan pengesanan isyarat banyak helai berlaku selari. | Ini memakan masa kerana pengesanan kimia dan pengesanan isyarat berlaku sebagai dua proses berasingan dan hanya pada helai boleh membaca pada satu masa. |
| Kebolehpercayaan | |
| NGS boleh dipercayai. | Jujukan Sanger kurang dipercayai |
| Saiz Sampel | |
| NGS memerlukan kurang jumlah DNA. | Kaedah ini memerlukan sejumlah besar DNA templat. |
| Pas DNA setiap Serpihan Terjujukan | |
| Bilangan asas DNA bagi setiap serpihan terjujukan adalah lebih rendah daripada kaedah Sanger | Menjana jujukan adalah lebih panjang daripada jujukan NGS. |
Ringkasan – NGS lwn Sanger Sequencing
NGS dan Sanger Sequencing ialah teknik penjujukan nukleotida yang digunakan secara meluas dalam Biologi Molekul. Penjujukan Sanger ialah kaedah penjujukan awal yang digantikan oleh NGS. Perbezaan utama antara NGS dan Penjujukan Sanger ialah NGS ialah proses yang berkelajuan tinggi, lebih tepat dan menjimatkan kos daripada penjujukan Sanger. Kedua-dua teknik mencipta wabak besar dalam Genetik dan Bioteknologi.
