Perbezaan Utama – Urutan Maxam Gilbert lwn Sanger
Nukleotida ialah unit struktur asas dan blok binaan DNA. Molekul DNA terdiri daripada rantai polinukleotida. Terdapat empat nukleotida berbeza yang terdapat dalam DNA. Nukleotida ini terdiri daripada empat bes nitrogen berbeza yang dinamakan A (adenine), G (guanine), C (sitosin), T (thymine). Susunan nukleotida dalam molekul DNA mempunyai kepentingan yang besar kerana ia mengekod maklumat genetik yang penting untuk pertumbuhan dan perkembangan organisma. Penjujukan DNA merujuk kepada proses yang menentukan jujukan nukleotida DNA yang tepat. Terdapat kaedah penjujukan DNA yang berbeza. Penjujukan Maxam Gilbert dan penjujukan DNA Sanger ialah dua kaedah penjujukan DNA yang tergolong dalam penjujukan generasi pertama. Prosedur penjujukan Maxam Gilbert menentukan jujukan asas dengan membelah secara kimia serpihan DNA berlabel hujung 5’ secara keutamaan pada setiap empat nukleotida dan elektroforesis gel. Prosedur penjujukan Sanger menentukan jujukan nukleotida dengan mensintesis DNA untai tunggal menggunakan polimerase DNA dan dideoksinukleotida dan elektroforesis gel. Ini ialah perbezaan utama antara Maxam Gilbert dan Penjujukan Sanger.
Apakah Penjujukan Maxam Gilbert?
Penjujukan Maxam Gilbert, juga dikenali sebagai kaedah penjujukan kimia, ialah teknik yang dibangunkan untuk menentukan susunan nukleotida dalam DNA. Kaedah ini telah diperkenalkan oleh W alter Gilbert dan Alan Maxam pada tahun 1976 dan menjadi popular kerana ia boleh dilakukan secara langsung dengan DNA yang telah dimurnikan. Kaedah Maxam Gilbert tergolong dalam penjujukan DNA generasi pertama, dan ia merupakan kaedah penjujukan pertama yang digunakan secara meluas oleh saintis.
Prinsip asas kaedah ini terletak pada sekatan serpihan DNA berlabel akhir pada bes tertentu oleh bahan kimia dan keadaan khusus asas dan pemisahan serpihan berlabel dengan elektroforesis seperti yang ditunjukkan dalam rajah 01. Serpihan diasingkan mengikut kepada saiz mereka pada gel. Oleh kerana serpihan dilabelkan, jujukan molekul DNA boleh disimpulkan dengan mudah.
Kaedah Maxam gilbert menggunakan bahan kimia khusus asas untuk memecahkan DNA pada asas tertentu. Dua bahan kimia biasa yang dinamakan bahan kimia dimetil sulfat dan hidrazin digunakan untuk menyerang purin dan pirimidin secara selektif.
Kaedah penjujukan Maxam Gilbert dilakukan melalui beberapa langkah seperti berikut.
- Pemurnian jujukan DNA menggunakan endonuklease sekatan
- Pelabelan hujung serpihan DNA dengan menambahkan fosfat radioaktif
- Pemurnian serpihan berlabel daripada serpihan tidak berlabel dengan elektroforesis gel
- Pemisahan DNA berlabel akhir kepada empat tiub dan dirawat dengan bahan kimia khusus asas secara berasingan
- Elektroforesis kandungan setiap tiub pada garisan berasingan pada gel dan pemisahan serpihan mengikut panjangnya.
- Pengesanan serpihan oleh autoradiograf.
Rajah 01: Penjujukan Maxam Gilbert
Apakah itu Penjujukan Sanger?
Sanger Sequencing ialah kaedah penjujukan yang dibangunkan oleh Frederick Sanger dan rakan-rakannya pada tahun 1977 untuk menentukan jujukan asas serpihan DNA tertentu. Ia juga dikenali sebagai penjujukan penamatan rantai atau kaedah penjujukan Dideoxy. Kaedah ini berfungsi berdasarkan prinsip penggabungan terpilih dideoxynucleotides penamat rantai (ddNTPs) seperti ddGTP, ddCTP, ddATP dan ddTTP oleh DNA polimerase semasa sintesis DNA untai tunggal untuk menamatkan pembentukan untai. Dideoxynucleotides kekurangan kumpulan OH 3' untuk pembentukan ikatan fosfodiester dengan nukleotida bersebelahan. Oleh itu, pembentukan helai berhenti sebaik sahaja ddNTP dimasukkan ke dalam helai yang baru terbentuk semasa penjujukan sanger.
Dalam kaedah ini, empat tindak balas sintesis DNA (PCR) berasingan dilakukan dalam empat tiub berasingan dengan satu jenis ddNTP. Keperluan lain juga dibekalkan untuk tiub untuk PCR termasuk primer, dNTP, polimerase Taq, keadaan khusus, dll. Empat tindak balas berasingan dilakukan dalam empat tiub dengan empat campuran. Selepas tindak balas PCR, serpihan DNA yang terhasil didenaturasi haba dan dipisahkan oleh elektroforesis gel. Kemudian serpihan divisualisasikan dengan menggunakan sama ada primer berlabel (radioaktif atau pendarfluor) atau dNTP seperti yang ditunjukkan dalam rajah 02.
Rajah 02: Jujukan Sanger
Apakah perbezaan antara Maxam Gilbert dan Penjujukan Sanger?
Maxam Gilbert lwn Sanger Sequencing |
|
| Penjujukan Maxam Gilbert ialah teknik pertama yang dibangunkan untuk penjujukan DNA. | Kaedah penjujukan Sanger diperkenalkan selepas kaedah penjujukan Maxam Gilbert. |
| Penggunaan | |
| Kaedah ini jarang digunakan. | Penjujukan Sanger digunakan secara rutin untuk penjujukan. |
| Penggunaan Bahan Kimia Berbahaya | |
| Ia menggunakan bahan kimia berbahaya. | Penggunaan bahan kimia berbahaya adalah terhad berbanding kaedah Maxam Gilbert. |
| Pelabelan untuk Pengesanan | |
| Kaedah ini menggunakan radioaktif P32 untuk melabelkan hujung serpihan DNA. | Penjujukan Sanger menggunakan ddNTP berlabel radioaktif atau pendarfluor. |
Ringkasan – Maxam Gilbert lwn Sanger Sequencing
Penjujukan Maxam Gilbert dan Sanger ialah dua jenis teknik penjujukan DNA yang terdapat di bawah penjujukan DNA generasi pertama. Penjujukan Maxam Gilbert ialah kaedah pertama yang diperkenalkan untuk penjujukan DNA pada tahun 1976, dan ia dilakukan dengan memecahkan serpihan DNA berlabel hujung oleh bahan kimia khusus asas. Oleh itu, ia dikenali sebagai penjujukan kimia. Kaedah penjujukan Sanger telah diperkenalkan pada tahun 1977, dan berdasarkan tindak balas penamatan rantai yang dipacu ddNTP. Kaedah penjujukan Sanger lebih popular daripada kaedah Maxam Gilbert kerana beberapa kelemahan kaedah Maxam Gilbert seperti penggunaan masa yang berlebihan, penggunaan bahan kimia berbahaya, dsb. Ini ialah perbezaan antara penjujukan Maxam Gilbert dan Sanger.
