Perbezaan Utama – RT PCR lwn QPCR
Tindak Balas Rantai Polimerase ialah teknik yang digunakan untuk menguatkan kawasan tertentu DNA secara in vitro. Disebabkan ciptaan teknik ini oleh Kary Mullis pada tahun 1983, saintis mampu membuat ribuan hingga jutaan salinan serpihan DNA tertentu untuk tujuan penyelidikan. Pada masa ini ia telah menjadi teknik yang biasa dan dilakukan secara rutin dalam makmal klinikal dan penyelidikan untuk pelbagai aplikasi. Terdapat variasi teknik PCR tradisional seperti RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, dll. RT PCR dan Q PCR ialah dua variasi penting PCR. Perbezaan utama antara RT PCR dan Q PCR ialah RT PCR digunakan untuk mengesan ekspresi gen melalui penciptaan transkrip DNA (cDNA) pelengkap daripada RNA manakala Q PCR digunakan untuk mengukur masa nyata produk PCR secara kuantitatif menggunakan pewarna pendarfluor.
Apakah RT PCR?
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) ialah varian PCR yang digunakan untuk mengesan ekspresi RNA. Ia adalah kaedah yang sangat penting untuk mengesan ekspresi mRNA dalam tisu. RT PCR digunakan apabila bahan permulaan sampel ialah RNA. Dalam RT PCR, mRNA templat mula-mula ditukar menjadi DNA pelengkap. Langkah ini dimangkinkan oleh enzim reverse transcriptase dan prosesnya dikenali sebagai reverse transcription. Kedua, PCR tradisional digunakan untuk cDNA yang baru disintesis untuk amplifikasi.
RT PCR ialah teknik yang sangat sensitif yang memerlukan jumlah sampel RNA yang agak kecil. RT PCR biasanya digunakan dalam diagnosis dan kuantifikasi spesies RNA, terutamanya virus RNA seperti virus kekurangan imun manusia dan virus hepatitis C.
Rajah 01: Teknik PCR RT
Apakah itu QPCR?
PCR Kuantitatif (QPCR) ialah varian PCR yang digunakan untuk mengukur produk PCR secara kuantitatif. Ia juga dirujuk sebagai tindak balas rantai polimerase masa nyata kerana ia mengukur penguatan masa nyata menggunakan mesin PCR masa nyata. Ia adalah kaedah yang sesuai untuk menentukan jumlah urutan sasaran atau gen yang terdapat dalam sampel. Ciri menarik QPCR ialah ia menggabungkan kedua-dua penguatan dan kuantifikasi sebenar ke dalam satu langkah. Oleh itu, keperluan untuk elektroforesis gel dalam pengesanan boleh dihapuskan dengan teknik QPCR. QPCR menggunakan pewarna pendarfluor untuk melabel produk PCR semasa tindak balas PCR yang akhirnya membawa kepada kuantifikasi langsung. Apabila produk PCR terkumpul, isyarat pendarfluor juga terkumpul dan ia akan diukur oleh mesin masa sebenar. QPCR boleh digabungkan dengan RT PCR. Ia dikenali sebagai RT – QPCR atau QRT – PCR dan dianggap sebagai kaedah yang paling berkuasa, sensitif dan kuantitatif untuk pengesanan tahap RNA dalam sel atau tisu.
SYBR Green dan Taqman ialah dua kaedah yang digunakan untuk mengesan atau menonton proses penguatan PCR masa nyata. Kaedah SYBR Green dijalankan menggunakan pewarna pendarfluor yang dipanggil SYBR green dan mengesan amplifikasi dengan mengikat pewarna untuk menghasilkan DNA untai berganda. Taqman dijalankan menggunakan probe dwi-label dan mengesan penguatan melalui degradasi probe oleh Taq polymerase dan pelepasan fluorophore seperti yang ditunjukkan dalam rajah 02. Kedua-dua kaedah memantau kemajuan proses penguatan dan melaporkan kuantiti masa nyata produk.
PCR masa nyata mempunyai pelbagai jenis aplikasi seperti kuantifikasi ekspresi gen, analisis RNA mikroRNA dan bukan pengekodan, genotaip SNP, pengesanan varian nombor salinan, pengesanan mutasi yang jarang berlaku, pengesanan organisma yang diubah suai secara genetik, pengesanan agen berjangkit, dsb.
Rajah 02: Teknik PCR kuantitatif
Apakah perbezaan antara RT PCR dan QPCR?
RT PCR lwn QPCR |
|
| RT PCR ialah teknik yang digunakan untuk mengesan ekspresi gen melalui amplifikasi. | QPCR ialah teknik yang menguatkan DNA dan mengukur produk PCR dalam masa nyata. |
| Penglibatan Enzim Transkripase Songsang | |
| Transkripase terbalik enzim digunakan untuk RT PCR. | Transkripase terbalik enzim tidak digunakan untuk QPCR. |
| Penggunaan Molekul Berlabel Pendarfluor | |
| Pewarna atau kuar berlabel pendarfluor tidak digunakan untuk RT PCR. | Pewarna atau kuar berlabel pendarfluor digunakan untuk QPCR. |
| Kuantifikasi produk PCR | |
| Melainkan digabungkan dengan QPCR, RT PCR tidak mengukur produk PCR. | QPCR mengukur secara kuantitatif produk PCR. |
| Bahan Permulaan | |
| Bahan permulaan ialah mRNA. | Bahan permulaan ialah DNA. |
| Sintesis cDNA | |
| DNA pelengkap dihasilkan semasa RT PCR. | DNA pelengkap tidak dihasilkan semasa QPCR. |
Ringkasan – RT PCR lwn QPCR
RT PCR dan QPCR ialah dua versi PCR tradisional. Teknik PCR RT dilakukan untuk sampel mRNA dan ia didorong oleh transkripsi terbalik dan pengeluaran cDNA. QPCR digunakan untuk mengukur produk PCR semasa kitaran terma PCR masa nyata menggunakan pewarna pendarfluor atau probe berlabel. Dalam QPCR, jumlah produk PCR diwakili oleh isyarat pendarfluor yang dipancarkan oleh sampel. RT PCR popular digunakan sebagai proses amplifikasi manakala QPCR biasanya digunakan sebagai proses kuantifikasi. Ini ialah perbezaan antara RT PCR dan QPCR.
